[생명공학 실험] 크기 배제 크로마토그래피 (Size-exclusion Chromatography, SEC)란? (원리 및 이용)

'생명공학 실험 끄적이기'의 이온 크로마토그래피 시간에서 이어,

오늘은 크기배제 크로마토그래피에 대해 끄적여보도록 하겠습니다.

 

*끄적이는 생명시간은 PC버전을 기준으로 작성되었습니다*

 

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크기 배제 크로마토그래피란?

크기 배제 크로마토그래피 (SEC, Size-exclusion chromatography)는 Gel filtration chromatography (GF)라고도 알려져 있습니다. SEC은 이름에서도 알 수 있듯이, 크기에 따라 물질을 분리하는 크로마토그래피입니다. 화학적 성질을 이용한 분리가 아니기에 다른 크로마토그래피에 비해 비교적 마일드한 크로마토그래피입니다.

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​크기 배제 크로마토그래피의 원리

: Size-exclusion chromatoraphy의 레진은 구멍이 뚫린 입자(porous particles)로 구성 되어있습니다. 따라서 물질이 레진을 통과하면서 입자의 구멍들을 통과하게 되죠. 이 때, 레진과 결합이 이루어지는 것이 아닌 경로를 제공하는 역할을 합니다.

 

크기 배제 크로마토그래피 레진 입자 - 출처: cytiva

 

쉽게 이해할 수 있도록 아래의 그림을 참고해주시기 바랍니다.

 

분자량에 따른 물질의 pathway- 출처: 자체 제작

 

분자량 (MW, molecular weight)이 큰 붉은 색 물질의 경우, 레진의 작은 구멍들을 통과하지 못하고 컬럼을 빠져나오게 됩니다. 반대로, 분자량이 작은 푸른 색 물질의 경우, 레진의 작은 구멍들을 지나오면서 컬럼을 빠져나오게 됩니다.

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즉, 붉은 색의 경우, 컬럼을 통과하는 경로가 짧기 때문에 빠르게 빠져나오고,

푸른 색의 경우, 컬럼을 통과하는 경로가 길기 때문에 상대적으로 느리게 빠져나오게 됩니다.

 

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다시 말해, 분자량의 크기와 레진을 통과하는 경로는 반비례 관계, 빠져나오는 속도와는 비례 관계가 되는 것이죠!

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Molecular weight ↑ > Path ↓> Speed ↑

Molecular weight ↓ > Path ↑> Speed ↓

 

따라서, 크로마토그램 상에서는 분자량이 클수록 좌측, 분자량이 클수록 우측에 peak이 나타나게 됩니다.

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크기 배제 크로마토그램 예시 - 출처: cytiva

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크기 배제 크로마토그래피의 이용

일반적으로 SEC은 분석용 또는 desalting을 위해 주로 사용합니다. SEC의 경우, 대량 정제를 목적으로 실험을 진행하는 것이 불가능하기 때문입니다. (아래부터는 '크기 배제 크로마토그래피'라는 용어 대신 'SEC'으로 사용하여 작성되었습니다.)

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SEC의 경우, 그 원리가 물질이 경로를 통과하는 속도에 따라 분리하는 것이기 때문에, 경로의 길이가 물질의 분리에 중요한 요소로 작용합니다. 따라서, 대량 정제를 위해서는 컬럼의 높이를 증가시켜야 하죠!

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하지만, 컬럼의 높이를 높이는 데에는 한계가 있습니다.

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공간적 한계

일반적으로 SEC을 위한 공간을 따로 마련하지 않는 이상, 일반적인 실험실과 공장은 공간 높이의 한계가 존재하죠!

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시간적 한계

SEC의 경우, 다른 크로마토그래피와 비교하였을 때, 상대적으로 낮은 유속을 사용하기 때문에 대량의 물질을 적용하는 것이 어렵습니다.

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물질의 한계

SEC은 시료를 적용하는 부피의 범위가 다른 크로마토그래피에 비해 좁고, 적은 부피의 시료를 요구합니다.

따라서, 단백질의 경우, 적합한 시료의 부피를 위해서는 시료의 농축이 필요한 경우가 생깁니다.

하지만 단백질은 농축 후 농도가 높아짐에 따라 점성이 생기고, 과도하게 농축하는 과정에서 aggregation이 발생할 가능성이 있기에 SEC을 이용한 대량 정제에는 한계가 있습니다.

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위와 같은 한계점으로 인해서 소량의 시료 분석 또는 소량 정제를 위해서 주로 사용됩니다.