안녕하세요. 끄적이는 생명시간입니다:)
오늘은 단백질 실험을 한다면 한 번 이상은 반드시 접해볼 SDS-PAGE 실험에 대해 끄적여보겠습니다.
*끄적이는 생명시간은 PC버전을 기준으로 작성되었습니다*
SDS-PAGE란?
SDS-PAGE란, Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis의 약자로, 단백질을 크기별로 분리할 때 사용하는 전기영동 실험입니다. 주로 단백질 정제 실험에서 많이 사용되는 실험이죠!
SDS-PAGE는 단백질 실험에서 기본으로 요구되는 실험이기에 다루지 않으려고 했으나, 단백질 실험에서 많이 사용되는 실험이니만큼 포스팅해보고자 합니다.
SDS-PAGE 실험 원리
SDS-PAGE를 구성하는 요소의 특성에 따라 실험의 원리를 살펴보도록 하겠습니다.
SDS-PAGE에는 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)와 Polyacrylamide가 가장 주된 요소이죠!
각 요소의 역할은 다음과 같습니다.
- SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS는 계면활성제로써, 단백질의 소수성 부분에 결합하여 단백질을 denaturation시키는 성질을 가지고 있습니다. 또한, SDS의 음전하가 단백질 고유의 net charge를 잃게 하고 전체적으로 음전하를 띌 수 있게 만듭니다.
denaturation 된 단백질의 전체 전하가 음전하를 띄기 때문에, 시료가 로딩되는 젤의 윗부분은 음전하 (-) charge, 아래 부분은 양전하 (+) charge의 전류를 흘려주어 음전하를 띈 단백질이 위에서 아래로 이동할 수 있도록 합니다.
2. Polyacrylamide
Polyacrylamide는 gel의 구성요소로, 촘촘한 체의 역할을 합니다. 흔히 DNA 젤 전기영동에 사용하는 Agar보다는 더 촘촘하기 때문에 크기가 작은 단백질 분리에 용이합니다. Polyacrylamide로 만든 SDS-PAGE 젤은 두 부분으로 구획이 나누어지는데요. 바로, Stacking gel 부분과 Seperating gel 부분입니다.
출처: Creative Proteomics
시료를 각 well에 로딩할 때 사람이 하기 때문에 균일하게 로딩되지 않는데요. 이러한 미묘한 차이에 의해 실험 결과에 차질이 생기는 것을 방지하기 위해 사용하는 것이 바로 Stacking gel입니다. 즉, 모든 시료들의 출발선을 동일하게 맞추기 위한 것이라고 생각하면 이해가 쉽겠습니다! 이후 Seperating gel에서 단백질이 이동하면서 시료 내의 단백질 분자가 사이즈에 따라 분리되게 됩니다.
그렇다면, 두가지 젤의 차이는 무엇일까요?
바로 pH와 acrylamide 함량입니다!
일반적으로 stacking gel은 acrylamide 함량이 낮고 (보통 4%), pH는 6.8을 사용합니다. seperating gel은 sacking gel보다 acrylamide 함량이 높고, pH는 8.8이상을 사용하죠!
그렇다면 각 젤의 조성에 차이는 어떤 효과를 나타낼까요??
Acrylamide 함량이 높은 이유: 더 촘촘한 젤을 구성하여 물질 분리를 더욱 효과적으로 하기 위함.
pH의 차이: 대부분의 SDS-PAGE running buffer는 Tris 또 Glycine을 포함하고 있습니다. 따라서, pH 6.8인 stacking gel에서는 소수의 glycine 분자만 해리됩니다. (아래 glycine에 대한 이해를 돕기 위해 그림을 첨부했으니 참고하시면 좋을 것 같습니다:))
Glycine의 전환 (출처: 위키백과)
따라서, 상부의 glycine과 하부의 cloride 이온(Cl-)의 농도차에 의해 이동하게 되고, 이에 따라 단백질이 stacking gel 가장 아래 단에 얇게 쌓이게 됩니다.
이 후, 높은 pH의 seperating gel에서는 glycine의 이동 속도가 단백질의 이동속도 보다 빠르게 이동하게 되고 따라서 단백질은 이온 농도와 상관 없이 gel의 acrylamide 함량에 의하여 분자량을 기반으로 이동 속도가 결정되는 것입니다.
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