안녕하세요. 끄적이는 생명시간입니다:)
오늘은 분자생물학 실험에서 많이 사용되는 클로닝(Cloning)에 대해 알아보는 시간을 가져볼까 합니다.
자, 본격적으로 시작해 보도록 하겠습니다.
*끄적이는 생명시간의 '제약, 바이오 용어 끄적이기', '생명 공학 실험 끄적이기'는 PC버전을 기준으로 작성되었습니다.*
클로닝이란?
제가 처음 분자 생물학 실험을 배울 때, 가장 도움이 되었던 책이 바로, T.A Brown의 "Gene Cloning & DNA analysis 6th edition"인데요. 개인적으로 정말 재미있게 공부했던 책입니다. 분자생물학 실험을 처음 접하시는 분들께 추천드려요! 설명이 쉽고 깔끔하게 잘 되어 있어서, 오늘은 이 책을 토대로 정리해 볼까 합니다.
클로닝이란, 간단하게 벡터(vector)라고 하는 유전자 운반체에 유전자 절편을 삽입하여, 세포에서 발현시키는 유저자 재조합 기술입니다.
그림과 함께 단계를 나누어 설명해보도록 하죠.
1. 유전자 절편을 유전자 운반체인 Vector에 삽입
2. 발현 세포에 재조합된 vector를 삽입
3. 발현 세포 내에서 재조합된 vector 유전자 복제
4. 발현 세포 분열
5. 재조합 vector가 들어있는 발현 세포가 무수히 많이 분열 및 복제되어 클론 형성
클로닝 단계
클로닝 실험의 단계는 크게 4단계로 나누어 설명할 수 있습니다. 일반적으로 사용하는 플라스미드를 이용한 클로닝에 대해 설명을 진행하겠습니다.
STEP 1. 타겟 DNA 절편 만들기
클로닝은 '이용하고자 하는 유전자'를 벡터에 삽입하는 기술이죠! 따라서, 원하는 타깃 유전자를 준비하는 것이 가장 처음 단계이겠죠?! 앞으로 타깃 DNA를 insert라 칭하도록 하겠습니다.
Insert DNA는 일반적으로 Genomic DNA에서 원하는 서열 부분만을 이용할 수 있도록 PCR을 진행하거나 cDNA를 합성하여 준비합니다. Genomic DNA를 추출하는 방법과 PCR, cDNA합성에 관한 부분은 아래 링크에 자세히 다루었으니, 필요하신 분들은 참고하시길 바라요:)
STEP 2. 제한효소 (Restriction Enzyme) 처리
제한효소란 DNA 서열을 자르는 효소입니다. 즉, 제한효소는 각각 특정한 유전자 서열을 인식하여 해당 부분을 절단하는 효소죠. 예를 들어, 가장 많이 사용되는 EcoRI의 경우 GAATTC 서열을 인식하여 구아니딘(G)과 아데닌(A) 사이를 절단합니다 (G/AATTC). 제한 효소가 DNA 서열을 자르는 방식은 두 가지로 나누어지는데요.
끝을 뭉뚝하게 자르는 'Blut End' 형식과 끝을 ㄱㄴ형태로 자르는 'Sticky End'형식입니다.
클로닝에서는 앞서 원하는 DNA를 추출할 때 끝부분을 제한효소를 처리할 수 있는 서열로 만들어 타깃 DNA 절편을 준비하게 됩니다. 이때, Insert유전자뿐만 아니라 사용할 벡터도 동일한 제한효소로 잘라 준비합니다. 그 이유는 라이게이션에서 설명하도록 하겠습니다.
STEP 3. 라이게이션 (Ligation)
라이게이션이란, 제한효소로 절단한 insert DNA 절편과 vector DNA를 붙여주는 단계입니다. 라이게이스(Ligase)라는 효소를 사용합니다. 라이게이션 단계에서 가장 중요한 것은 전 단계인 제한효소 처리에서, insert와 vector에 동일한 제한효소를 처리해 주는 것입니다.
동일한 제한효소를 처리하는 이유는 동일한 서열로 절단된 DNA 말단끼리 서로 상보적으로 결합이 가능하기 때문입니다. 일반적으로 제한효소가 인식하는 DNA 서열은 좌우 대칭으로 이루어져 있기 때문에 동일한 제한효소를 사용하여 잘린 DNA는 상보적으로 결합이 가능합니다.
가장 이상적인 라이게이션 비율은 insert DNA:Vector DNA=3:1입니다. 이때 헷갈리지 말아야 할 것은 insert와 vector는 길이(사이즈)가 다르기 때문에 molar ratio가 3:1이어야 한다는 점입니다.
아래의 공식을 이용하면 실험을 할 때 계산하기 편하지 외워두거나 메모해 두면 좋겠죠?
[{(vector 양, ng) x (insert 크기, kb)}/(vector 크기, kb)] x {(insert의 몰질량)/(vector의 몰질량)} = insert의 양, ng
이렇게 나열되어 있으니, 한 번에 들어오지는 않죠?
예를 들어 설명해 보도록 하겠습니다.
Insert DNA의 크기 = 500 bp
Vector DNA의 크기 = 2 kb
Vector의 양 = 50 ng
라이게이션에 사용할 molar ratio = 3:1 (Insert : Vector)
위와 같은 조건일 때, 필요한 insert DNA의 양은 얼마일까요?
Insert DNA의 양 (ng)
= [(50ng x 0.5kb)/2kb] x 3/1 = 150 ng
이렇게 직접 대입해 보니 쉽죠? 비율로 계산하기 때문에 한 번 이해하면 이후에는 쉽게 적용이 된답니다!
STEP 4. 형질전환(Transformation)
형질전환은 라이게이션 단계에서 Insert DNA와 Vector DNA가 결합된 재조합 DNA를 발현하고자 하는 세포에 집어넣는 단계입니다. 발현하는 세포는 Competent cell이라는 형질전환을 위한 세포를 사용합니다. Competent cell은 컴셀(Com cell)이라고도 합니다.
DNA를 주입하는 형질 전환 방법은 아래 두 가지 방법이 가장 흔히 사용되는 방법입니다.
1) 화학적 방법: 칼슘이온(Ca2+)으로 처리한 competent cell은 세포벽/막의 투과성이 높기 때문에 조금 높은 온도에서 세포 외부의 재조합 DNA를 효과적으로 세포 내로 투과하게 됩니다. 이는 heat shock 방법이라고도 합니다.
2) 전기적 방법: Electrophoresis라고도 하며, 강한 전기를 짧게 세포에 가하여 순간적으로 세포벽을 지나 재조합 DNA를 세포 내로 투과시키는 방법입니다.
위의 4단계를 통해 재조합된 DNA가 형질전환 세포에 주입되고, 이를 통해 인서트 DNA가 담고 있는 정보의 단백질이 발현되게 됩니다!
제약/바이오업계에서는 유전자 서열을 modify 하거나 돌연변이를 일으키는 방식 등으로 타깃 DNA를 제작하고 이를 발현시켜 의약품을 개발하는 데 사용합니다.
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