[생명공학 실험] 친화성 크로마토그래피 (Affinity Chromatography)란?

안녕하세요. 끄적이는 생명시간입니다:)

 

지난번에는 크로마토그래피의 원리와 크로마토그래피의 종류에 대해 알아보았습니다.

궁금하신 분들은 아래 링크를 확인해 주세요:)

 

[생명공학 실험] 단백질 정제의 기본! 크로마토그래피(Chromatography)란? 1편

[생명공학 실험] 단백질 정제의 기본! 크로마토그래피(Chromatography)란? 1편

[생명공학 실험] 단백질 정제의 기본! 크로마토그래피(Chromatography)란? 2편

[생명공학 실험] 단백질 정제의 기본! 크로마토그래피(Chromatography)란? 2편

 

오늘은 크로마토그래피의 종류인 친화성 크로마토그래피 (Affinity Chromatography, AC)에 대해 자세히 다루어보겠습니다.

 

*끄적이는 생명시간은 PC버전을 기준으로 작성되었습니다*

 

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친화성 크로마토그래피(Affinity Chromatography, AC) 란?

크로마토그래피의 matrix에 붙어있는 특정한 리간드(ligand)와 단백질 간의 가역적 상호작용에 의해서 단백질을 분리하는 크로마토그래피 기법이에요.

 

친화성 크로마토그래피의 특징 및 장점

1. 결합/용출(bind/elute)를 기반으로 하기 때문에 민감도(sensitivity)가 높고, 그로 인하여 분리능(resolution)이 우수

2. 컬럼에 적용되는 시료의 부피보다 용출되는 부피를 줄일 수 있기 때문에 정제 과정 중에 단백질 시료의 농도를 높일 수 있음

3. 친화성 크로마토그래피는 프로테아제(protease)와 같은 오염물 (contaminants)을 제거하는 데 효과적

 

 

 

친화성 크로마토그래피의 원리와 정제 방법

친화성 크로마토그래피는 앞서 설명하였듯이, matrix에 붙어있는 특정한 리간드와의 가역적 상호작용 (reversible interaction)에 기초하여 단백질을 분리하는 크로마토그래피 기법이에요.

출처: cytiva

1. 친화성 크로마토그래피의 레진(resin) 구성 요소

- Matirx: 화학적, 물리적으로 불활성화된 물질

- Spacer arm: 리간드와 타깃 단백질 사이의 결합이 용이할 수 있도록 하는 물질

- Ligand: 타겟 분자들과 가역적으로 결합할 수 있는 물질

 

 

2. 친화성 크로마토그래피의 결합/용출 방법

1) 가장 단순한 방법으로, 완충액(buffer)의 조성 변경에 의한 용출 방법

*완충액(buffer): 산이나 염기를 가해도 pH가 크게 변하지 않는 용액

2) 용출(elution)단계에서 pH나 고농도의 chaotropic(소수성 효과)의 급격한 변화를 이용하여 물질을 용출하는 방법

- 이 방법은 영구적이거나 일시적인 변화를 유발할 수 있기 때문에 해당 부분에 대한 효과를 인지하고 있어야 해요!

3,4) 리간드에 결합한 타겟타깃 물질 대신 리간드에 결합할 수 있는 물질을 가하여 타깃 물질을 용출하는 방법

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각 방법은 리간드와 타겟 단백질의 성질에 따라 선택하여 사용할 수 있어요.

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3. 용출 방법 (elution)

친화성 크로마토그래피를 이용하여 타깃 단백질을 용출하는 방법은 두 가지가 있어요!

바로 gradient elution과 step elution인데요. 각각을 이용하는 목적은 다음과 같아요.

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왼쪽: Step elution, 오른쪽: Gradient elution (출처: cytiva)

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- Gradient elution, 점진적 용출

: 불순물(imurity)를 제거하는 목적 또는 여러 개의 물질이 혼합되어 있는 시료의 분리가 필요할 때 사용합니다.

용출 조건을 점차적으로 변화시키면서 타겟으로 하는 단백질이 용출되는 포인트를 찾음으로써, 불순물과 분리하고 순도 높은 타깃 단백질을 얻을 수 있는 것이지요. 이러한 이유 때문에 공정 개발 단계에서 정제 단계를 최적화(optimization)하기 위하여 사용합니다.

점진적인 변화를 주어야 하기 때문에 elution 시간이 조금 긴 편이에요!

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- Step elution, 단계 용출

: Step elution은 용출이 한 가지 조건에 의해서 이루어지고 그렇기 때문에 최적화단계에서 얻어진 포인트를 용출 조건으로 하여 사용합니다. 이미 정해진 조건으로 한 번에 적용하여 타겟 단백질을 분리하기 때문에 gradient elution보다는 elution 시간이 짧은 편이에요!

 

 

정제 단백질의 종류에 따른 레진 선택

Affinity chromatography를 사용하기 위해서는 타깃 단백질이 어떤 리간드에 의해 분리될 수 있는지 생각해봐야 해요.

Affinity chromatography에 사용되는 리간드와 이용할 수 있는 단백질의 특성은 다음과 같아요!

타깃

단백질의 특성에 따라 적합한 레진 리간드를 선택하여 사용할 수 있어요!

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정제 공정 개발에서의 Affinity Chromatography

공정 개발에서의 Affinity chromatography (친화성 크로마토그래피)는 정제 공정 개발에서 사용되는 CIPP (Capture, Intermediate Purification and Polishing) process에서 capture와 intermediate step에 주로 이용됩니다. CIPP는 제약 산업과 연구에서 사용되는 전략 방법으로 효율적인 공정 개발이 가능하도록 해주는 프로세스 과정을 나타냅니다.

출처: cytiva

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- Capture Step은 표적 단백질을 분리, 농축, 안정화시키기에 적합해야 해요. 또한, 물질의 활성 등이 보존되어야 합니다.

- Intermediate Step은 타겟 단백질 외의 단백질 분자, 핵산(nucleic acids), 엔도톡신(endotoxin), 바이러스 등과 같은 대량의 불순물을 제거할 수 있어야 해요.

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정제 공정 개발에서 사용되는 CIPP process에서 친화성크로마토그래피는 물질을 잡는 즉, capture 하는 능력이 우수하고 빠른 정제 속도, 높은 분리능, 타깃 단백질과 리간드의 특이적인 결합 등으로 인하여 capture와 intermediate step에서 주로 이용됩니다.

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affinity chromatography는 가장 흔히 쓰이는 크로마토그래피 중 하나에요!

위에서 설명한 것과 같이 물질의 분리에 용이하고 다음 정제 또는 공정 과정을 위한 시료의 농축이 가능하다는 점에서 연구적 측면뿐 아니라 제약 산업에서도 널리 쓰이는 실험 방법입니다.