분자 생물학 실험의 기본! PCR이란?
안녕하세요. 끄적이는 생명시간입니다:)
오늘은 분자생물학 실험의 기본인 'PCR'에 대해 끄적여보고자 합니다.
*끄적이는 생명시간의 '제약, 바이오 용어 끄적이기', '생명 공학 실험 끄적이기'는
PC버전을 기준으로 작성되었습니다.*
PCR이란?
PCR은 국문으로는 중합 연쇄 반응이라고도 하며 1980년대 Kary Mullis에 의해서 개발된 실험법입니다.
PCR은 쉽게 말하자면, DNA polymerase를 사용하여 새로운 DNA를 합성하는 실험법입니다.
자, 그렇다면 이제부터 PCR에 필요한 구성요소와 그 과정이 어떻게 이루어지는지 알아보도록 하겠습니다.
PCR을 위한 구성 요소
1. DNA Template (주형 DNA)
DNA template은 복제를 위한 타겟 서열이 됩니다. 즉, 복제 및 증폭하고자 하는 DNA 서열입니다.
2. DNA Polymerase (DNA 중합효소)
DNA를 복제하기 위한 효소로써 타겟 DNA를 상보적으로 합성하기 위하여 쓰입니다.
중합효소의 종류는 두 가지가 있습니다.
첫번째로는, TaqDNA polymerase입니다.
이 중합효소는 최초로 사용된 중합효소이며, 가장 일반적인 중합효소입니다.
- Taq polymerase는 고온에서도 생존하는 Thermus aquaticus로부터 개발된 효소이기 때문에
PCR이 진행되는 동안 사용되는 고온에서도 저항성을 가지고 있어 널리 쓰이는 중합효소입니다.
- Taq polymerase는 75-80 ºC에서 활성화되기 때문에 해당 온도 범위에서 실험을 진행하는 것이 적합합니다.
- Taq polymerase는 10초 내에 1000bp의 복제가 가능하며 75-80 ºC에서는 초당 150bp의 복제가 가능합니다.
- 또한, Taq polymerase는 5'-3' nuclease proofreading 기능이 있습니다.
두 번째로는,PfuDNA polymerase입니다.
이 중합효소는 DNA 복제 품질이 좋아 많이 사용되는 중합효소입니다.
- Pfu polymerase도 Taq polymerase과 비슷하게 고온에서 사는 Pyrococcus furiosus에서 발견된 효소입니다. 따라서 마찬가지로 고온에 대한 저항성을 가지고 있어 PCR에 사용됩니다.
- Pfu polymerase는 3'-5' exonuclease proofreading activity를 가지고 있습니다. 따라서, 높은 정확도를 가지는 polymerase입니다.
(*Exonuclease proofreading activity란, DNA가 합성되는 과정에서 잘못 매치된 뉴클레오타이드가 있는지 확인하고, 있다면 이를 제거하는 능력을 말합니다.)
- 하지만 Pfu polymerase의 합성 속도는 72 ºC에서 진행했을 때, DNA 증폭 단계 1 cycle 당 1-2 min이 걸릴 정도로 속도가 느리다는 단점이 있습니다.
"그렇다면, 어떤 polymerase가 더 효과적인 것일까요?"
각각의 polymerase가 장단점이 있기 때문에 진행하는 실험에 따라 선택하여 효과적으로 사용하시면 됩니다.
제 경우, 대학원 때는 클로닝을 위해 PCR을 진행하는 경우에는 높은 정확도로 DNA를 증폭하는 것이 중요하였기에 Pfu polymerase를 사용하고, 클로닝 이후 타깃 DNA가 발현 세포에 정확히 들어갔는지빠르게 확인하기 위해서 Taq polymerase를 사용하였습니다.
3. Primer (프라이머)
Primer는 DNA과 상보적으로 결합하는 짧은 단일 단편을 말합니다. 위에서 설명한 polymerase가 타깃 DNA에 달라붙은 primer를 시점으로 새로운 single DNA를 합성합니다.
4. Nucleotides, dNTPs or deoxynucleotide triphosphages (뉴클레오타이드)
뉴클레오타이드는 핵산을 구성하는 분자로서, 염기, 당, 인산으로 구성되어있습니다.
DNA를 구성하는 뉴클레오타이드의 염기는 4가지로 구성되어 있습니다.
퓨린 계열: 구아닌(Guanine, G), 아데닌(Adenine, A)
피리미딘 계열: 티민(Thymine, T), 사이토신(Cytosine, C)
위의 네 가지 염기는 상보적으로 결합합니다.
퓨린 계열과 피리미딘 계열이 서로 상보적으로 결합하며, 결합하는 염기쌍은 다음과 같습니다.
구아닌은 사이토신과, 아데닌은 티민과 상보적으로 결합하여 DNA을 구성합니다.
PCR을 진행할 때는, 이 네 종류의 염기가 들어있는 dNTPs mixture를 사용하여 타깃 DNA에 염기가 상보적 쌍을 이루어 복제될 수 있도록 합니다.
PCR의 과정
자, PCR이 무엇인지, PCR을 진행하기 위해 필요한 준비물이 무엇인지 알아보았습니다.
위에서 설명한 내용을 바탕으로 PCR이 어떠한 원리로 이루어지는지 설명해 보도록 하겠습니다.
PCR은 총 3개의 단계로 이루어지며, 이 3 단계를 반복해서 DNA를 증폭시키는 원리입니다.
STEP 1. Denaturation
PCR의 첫 단계는 Denaturation으로
타깃 DNA 이중나선에 고온을 가하여 상보적 결합(수소 결합)을 분리하는 단계입니다. 이렇게 분리되어 나온 single-stranded(단일) DNA는 새로운 DNA strand 합성을 위한 template으로 작용하게 됩니다. 일반적으로 denaturation은 0.5-2 분 정도 94-96 ºC의 고온을 가하여 진행합니다.
STEP 2. Annealing
Denaturation 단계에서 분리된 single-stranded DNA에 primer 단편이 상보적으로 결합하는 단계입니다. Primer는 template DNA의 3'-5' 방향에 5'-3' 방향으로 결합합니다. 비교적 낮은 온도에서 진행되며 일반적으로 54-60 ºC에서 20-40초 정도 열을 가하여 진행합니다.
STEP 3. Extension/Elongation
마지막 단계는 타깃 DNA에 상보적으로 결합한 primer에 DNA polymerase가 결합하여 타겟 DNA에 상보적인, 새로운 염기를 추가하면서 DNA single strand를 합성해나가는 단계입니다. 일반적으로 72-80 ºC에서 진행됩니다.
PCR과정은 위 3단계를 20-40 단계를 반복하여 DNA를 증폭시키게 됩니다.
Elongation 시간은 사용하는 polymerase에 따라, 타겟 DNA의 길이에 따라 다르게 적용합니다.
Taq polymerase는 분당 1 kb 길이의 DNA 합성이 가능하며,
Pfu polymerase 분당 0.5 kb 길이의 DNA 합성이 가능합니다.
따라서, 만약 타겟 DNA의 길이가 1.5kb일 때,
Taq polymerase를 사용하는 경우 1.5분, Pfu polymerase를 사용하는 경우 3분으로 설정하여 진행하면 되겠죠?
PCR의 한계
PCR은 꽤 효과적이고 간단하면서 효율적으로 DNA를 증폭시킬 수 있는 방법이지만,
여느 실험과 유사하게 한계가 존재합니다.
PCR은 1) 고도로 예민한 기술이기 때문에 단 한 개의 염기라도 잘못 합성되는 경우 최종 실험 결과에 엄청난 영향을 미칠 수 있습니다. 2) 또한, primer를 디자인해서 사용하기 때문에 증폭하고자 하는 타깃 DNA의 서열을 알고 있어야 하죠.3)뿐만 아니라 제작한 primer가 목표로 하는 타깃 DNA 내의 서열이 아닌 유사한 서열에 가서 결합할 가능성도 있죠. 4) 때에 따라서는 primer들끼리 이중나선을 만들어 타겟 DNA에 결합하지 않는 경우도 생깁니다. 따라서, 모의 PCR 프로그램을 통해 디자인한 primer가 타겟 DNA의 위치에 결합하는지 확인해 보는 것이 좋습니다. 5) 그리고 매우 낮은 확률이지만 DNA polymerase의 오류로 잘못 합성되는 경우도 있습니다.
여러 가지 오류가 발생할 가능성이 있지만, PCR은 분자생물학 실험에 있어서 기초가 되기에 많은 실험에서 사용됩니다. 따라서, 우리가 할 수 있는 최선의 방법은 오류가 최대한 발생하지 않도록 한 단계 한 단계 신중하게 확인하여 진행하는 것입니다.
오늘은 비교적 간단하게 PCR에 대해서 끄적여보았습니다.
도움이 되셨길 바라며,
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출처
1. National Library of Medicine (NIH)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/ (27Jan2023)
2. Difference Between.com
https://www.differencebetween.com/what-is-the-difference-between-taq-and-pfu-polymerase/ (27Jan2023)